Уважаемые пользователи!

Данный сайт содержит информацию для людей с медицинским образованием и специалистов здравоохранения.
Входя на сайт, Вы подтверждаете свое согласие с Условиями использования и Политикой конфиденциальности.



Dear visitor!
This site contains medical information for healthcare professionals.
You can go further, if you agree with Terms and Conditions and Privacy Policy on this site.

Prognostic value of somatic mutation testing and different methods of treatment of low-risk differentiated thyroid cancer

Cover Page

Abstract


Background: Using molecular testing for prediction the course of the disease could possibly help doctors in making therapeutic decisions about the management of patients, because it remains controversial issues in low-risk differentiated thyroid cancer patients. The expert’s opinions are different on the volume of treatment of these patients: the adequacy of hemitireoidectomy, the need to remove the lymph nodes of the central zone (level VI) and the need for radioiodine therapy.

Aims: to evaluate the frequency of recurrences in different complex treatment options of low-risk differentiated thyroid cancer; to evaluate the frequency of somatic mutations in the hot spots of BRAF, KRAS, KRAS, EIF1AX and TERT genes in histological material and to evaluate their prognostic value.

Materials and methods: A prospective, observational, cohort, sample, single-center, open-label, controlled, nonrandomized clinical trial was performed, which included patients with the thyroid neoplasms, recruited in the period from 2012 to 2014. Samples of histological material were tested for the presence of somatic mutations in hot spots of the genes BRAF, KRAS, NRAS, TERT, and EIF1AX. After the treatment, the low-risk differentiated thyroid cancer patients group were observed for 43–68 months.

Results: The study included 90 patients with low-risk well differentiated thyroid cancer. Mutations in the hot spots of the BRAF gene (exon 15, codon area 600-601) were found in 53 patients, mutations in the hot spots of the NRAS gene (exon 3, codon 61) – in 3 patients; mutations in the hot spots of the KRAS, TERT and EIF1AX genes were not detected. The median follow-up in the well differentiated thyroid cancer group was 56 months. Recurrence diagnosed in 12 patients (13.3%), significant differences in the frequency of recurrence depending on the surgical treatment option was not revealed, significant differences in the frequency of recurrence between the groups BRAF+/BRAF was not revealed.

Conclusions: Low-risk well differentiated thyroid cancer patients have characterized a very favorable the course of disease and prognosis, even in the case of recurrence. In this study, complex treatment has not shown significant advantages over thyroidectomy in treating patients with thyroid microcarcinomas. Mutation testing of histological material in hot spots of genes BRAF, KRAS, NRAS, EIF1AX and TERT can’t be used as an additional marker in low-risk well differentiated thyroid cancer patients to predict the course of the disease, although the lack of detection of aggressive genes of the disease may indicate a favorable prognosis in these patients.


Обоснование

Большинство пациентов с высокодифференцированным раком щитовидной железы (ВДРЩЖ) имеют отличный прогноз, со средней 20-летней выживаемостью после удаления опухоли выше 90%. Клиническая проблема по-прежнему заключается в выявлении подмножества опухолей, которые имеют агрессивное биологическое поведение и поэтому оказывают негативное влияние на течение заболевания и смертность пациентов.

Согласно российским клиническим рекомендациям по диагностике и лечению ВДРЩЖ у взрослых 2017 г., при опухоли от 1 до 4 см без экстратиреоидной инвазии и/или метастатических лимфоузлов гемитиреоидэктомия является адекватным объемом операции у пациентов с ВДРЩЖ низкого риска [1]. Тем не менее по данному вопросу существует множество споров, поскольку при проведении гемитиреоидэктомии сложно проводить адекватное наблюдение за пациентом в послеоперационном периоде с использованием тиреоглобулина (ТГ). Дискутируется также проведение профилактического удаления лимфатических узлов центральной зоны (VI уровень) (ЦЛАЭ) в группе пациентов с ВДРЩЖ низкого риска, оно показано лишь при имеющихся дооперационных данных о наличии метастазов в этой зоне или при выявлении их интраоперационно. Преимущества профилактического удаления лимфатических узлов спорны в связи с отсутствием достоверных данных о положительном влиянии на прогноз. В то же время частота метастатического поражения неизмененных по данным дооперационного обследования лимфатических узлов центральной зоны составляет 25–30%, а в условиях невыполненной ЦЛАЭ возможна проблема неточности послеоперационного стадирования по TNM.

Удаление остаточной ткани щитовидной железы (ЩЖ) с помощью радиойодтерапии (РЙТ) облегчает раннее выявление прогрессирования заболевания при изучении сывороточного ТГ и сцинтиграфии всего тела (СВТ) с изотопами йода в дальнейшем. РЙТ позволяет уничтожить микроскопические остатки опухоли, оказывает положительное влияние на прогноз. Однако для пациентов группы низкого риска (пациенты с солитарной опухолью T1N0M0 размером менее 2 см, без признаков экстратиреоидного распространения) она рутинно не показана в связи с тем, что ее значение до конца не выяснено, не были выявлены достоверные данные о снижении частоты рецидивов и риска летального исхода.

Таким образом, необходимо проведение дополнительных исследований для понимания оптимального объема операции, необходимости ЦЛАЭ и необходимости назначения РЙТ в группе пациентов низкого риска.

В нашем исследовании мы решили оценить панель соматических мутаций в “горячих точках” генов BRAF, KRAS, NRAS, EIF1AX, TERT, поскольку их обнаружение ассоциировано не только с РЩЖ, но и с более агрессивным течением заболевания.

Ген BRAF кодирует цитоплазматический белок, участвующий во внутриклеточной передаче сигнала от рецепторов факторов роста. Мутации гена BRAF чаще всего локализуются в 15-м экзоне гена BRAF (кодоны 600–601), реже встречаются “неклассические” мутации в 11-м и 15-м экзонах гена BRAF (в районе кодонов 469, 570–598, 603–605) [2, 3].

Данные исследований влияния мутации в гене BRAF на прогноз свидетельствуют о том, что в целом BRAF V600E-позитивные опухоли имеют более высокий риск агрессивного течения заболевания, рецидива и смертности. Изолированно BRAF V600E является относительно чувствительным, но не специфическим маркером рецидива опухоли и связанной с ней смертности.

Метаанализ 14 исследований, включающий в общей сложности 2470 пациентов, показал, что мутация BRAF V600E встречалась в целом в 45% случаев, была статистически значимо связана с рецидивом опухоли, метастазами в лимфатические узлы, экстратиреоидным распространением. Более агрессивное течение заболевания встречалось в 25% случаев BRAF-позитивных опухолей в сравнении с 13% BRAF-негативных опухолей [4].

Кроме того, в большом многоцентровом исследовании 1849 пациентов было показано, что наличие мутации BRAF V600E значительно связано с увеличением смертности от папиллярного РЩЖ (ПРЩЖ). Общая смертность составила 5% у пациентов с мутацией BRAF V600E и 1% у пациентов без мутации BRAF [5].

Согласно данным обзора G. Howell (2013) [6], мутации RAS являются вторыми по распространенности после BRAF, однако их роль до конца не понятна, поскольку они встречаются при всех патоморфологических типах новообразований ЩЖ от доброкачественных до анапластического рака. Гены NRAS и KRAS кодируют цитоплазматические белки, участвующие во внутриклеточной передаче сигнала от рецепторов факторов роста. Ген NRAS относится к протоонкогенам, и активирующие соматические мутации обнаруживаются в этом гене примерно в 15% случаев всех злокачественных опухолей человека. Мутации NRAS чаще всего локализуются в экзоне 3 (кодоны 59 и 61) и реже в экзоне 2 (кодоны 12 и 13) или в экзоне 4 (кодоны 117 и 146). Ген KRAS также относится к протоонкогенам, активирующие соматические мутации в этом гене обнаруживаются примерно в 30–40% случаев всех злокачественных опухолей человека. Мутации KRAS чаще всего локализуются в экзоне 2 (кодоны 12 и 13) и реже в экзоне 3 (кодоны 59 и 61) или в экзоне 4 (кодоны 117 и 146) [2, 3].

Суммируя данные нескольких исследований, было установлено, что частота выявления мутаций RAS составила 26% (54/207) при фолликулярных аденомах (ФА), 40% (71/179) при фолликулярном РЩЖ (ФРЩЖ), 11% (22/206) при ПРЩЖ, 33% (24/73) при низкодифференцированном РЩЖ, 53% (22/47) при анапластическом РЩЖ. На сегодняшний день данные о прогностической значимости RAS-позитивных РЩЖ противоречивы. В некоторых исследованиях выявлена клинически значимая ассоциация между RAS-мутацией и риском отдаленных метастазов и снижением выживаемости. Кроме того, частота выявления RAS-мутаций при низкодифференцированном и анапластическом РЩЖ выше, чем при других типах РЩЖ [6].

Ген TERT кодирует каталитическую субъединицу теломеразной обратной транскриптазы, ядерный белок, выполняющий ключевую роль в реакции поддержания длины теломер.

Мутации гена TERT являются новыми перспективными диагностическими и прогностическими маркерами РЩЖ как сами по себе, так и в сочетании с мутацией BRAF V600E или другими генетическими маркерами (например, мутациями RAS). Они оказываются клинически значимыми при лечении РЩЖ [7–9].

Мутация TERT ассоциирована с более агрессивным течением РЩЖ. Частота встречаемости мутации TERT в исследовании X. Liu (2013) [10] составила для мутации C228T 0% (0/85) случаев доброкачественных новообразований, 11,7% (30/257) ПРЩЖ и 37,5% (3/8) низкодифференцированного РЩЖ, 42,6% (23/54) анапластического рака и 66,7% (8/12) для обоих мутаций C228T и C250T (которая является менее распространенной), 13,9% (11/79) для ФРЩЖ, 46,3% (25/54) анапластического рака. Не было выявлено мутации TERT ни в одном из 16 образцов медуллярного РЩЖ. Мутация C228T была ассоциирована с BRAF V600E-мутацией при ПРЩЖ: была обнаружена в 18,3% (19/104) BRAF-позитивного ПРЩЖ и в 7,2% (11/153) BRAF-негативного ПРЩЖ [10].

В обзоре R. Liu (2016) [11] представлены данные об онкогенной роли мутации TERT, в нем также повторяются данные о том, что частота встречаемости мутации C228T гораздо выше, чем C250T. В обзоре показана ассоциация с агрессивными типами РЩЖ: общая распространенность мутаций составляет в среднем: 0% в доброкачественных опухолях ЩЖ, 11,3% при ПРЩЖ, 17,1% при ФРЩЖ, 43,2% при низкодифференцированном РЩЖ и 40,1% при анапластическом РЩЖ. Мутации TERT связаны с агрессивными характеристиками опухоли ЩЖ, рецидивом опухоли и смертностью пациентов, а также мутацией BRAF V600E. Сосуществующие мутации промотора TERT и BRAF V600E оказывают сильное синергетическое влияние на агрессивность ПРЩЖ, включая увеличение риска рецидива и смертности пациентов, в то время как любая мутация сама по себе оказывает скромное влияние [11].

В обзоре A. Jin (2018) [12] было показано, что распространенность мутации TERT при дифференцированных типах РЩЖ составляет 10% (425/4240), из них C228T составляет 86,1% мутаций, C250T – 12,0% и другие типы – 2,1%. Наличие мутации ассоциировано со значительно возрастающим риском более агрессивного течения РЩЖ. Частота встречаемости мутации TERT достигает 56,8% при анапластическом РЩЖ, 38,5% при низкодифференцированном РЩЖ, 9,2% при ФРЩЖ, 7,2% при ПРЩЖ и 0% при медуллярном РЩЖ. Статистически значимые ассоциации были найдены также между мутацией TERT и большим размером опухли, старшим возрастом, экстратиреоидным распространением, метастазами в лимфатические узлы, отдаленными метастазами, продвинутой стадией TNM, рецидивом опухоли и мутацией BRAF. При одновременном обнаружении мутаций TERT и BRAF более вероятен плохой прогноз и исход [12].

Ген EIF1AX кодирует цитоплазматический белок, участвующий в трансляции (синтезе белка на матрице мРНК). Мутации гена EIF1AX были обнаружены ранее только при ПРЩЖ и анапластическом РЩЖ. Распространенность этих мутаций при других видах РЩЖ и в доброкачественных новообразованиях была неизвестна. Однако в исследовании A. Karunamurthy (2016) [13] была проанализирована частота мутаций EIF1AX в экзонах 2, 5 и 6 гена в серии 266 опухолей ЩЖ. Мутации EIF1AX были обнаружены в 2,3% (3/86) ПРЩЖ, 25% (1/4) анапластического РЩЖ, 0% (0/53) ФРЩЖ, 0% (0/12) медуллярного РЩЖ, 7,4% (2/27) ФА и 1,3% (1/80) гиперпластических узлов ЩЖ. Таким образом, данное исследование показало, что мутации EIF1AX обнаруживаются не только при РЩЖ, но и при доброкачественных новообразованиях. Кроме того, в нескольких случаях РЩЖ было обнаружено сочетание мутаций в генах EIF1AX и RAS. Так, при фолликулярных опухолях ЩЖ одновременное обнаружение мутаций в генах EIF1AX и RAS однозначно говорит о злокачественном характере опухоли. При анапластическом РЩЖ наличие мутации в гене EIF1AX является предиктором особенно агрессивного течения заболевания [13].

Цель

Оценить частоту рецидивов при различных вариантах лечения при ВДРЩЖ низкого риска (тиреоидэктомия (ТЭ), ТЭ + ЦЛАЭ, ТЭ + ЦЛАЭ + РЙТ, ТЭ + РЙТ), встречаемость соматических мутаций в “горячих точках” генов BRAF, KRAS, NRAS, EIF1AX и TERT в гистологическом материале и их прогностическое значение.

Методы

Дизайн исследования

Проведено проспективное наблюдательное когортное одноцентровое открытое контролируемое нерандомизированное клиническое исследование, схема представлена на рис. 1.

 

Рис. 1. Схема исследования.

 

Критерии соответствия

Критерии включения: пациенты обоих полов, возраст старше 18 лет, размер новообразования ЩЖ менее 2 см, отсутствие признаков метастазирования или экстратиреоидного распространения по данным УЗИ, что соответствовало стадии T1 низкого риска (по версии TNM 2009 г.), диагноз ВДРЩЖ по результатам гистологического заключения.

Критерии исключения: некомпенсированный тиреотоксикоз, проведенная ранее операция на ЩЖ, отягощенный анамнез по наследственным и семейным формам заболеваний ЩЖ, повышенный уровень кальцитонина.

Условия проведения

В исследование включали пациентов, находившихся на лечении в хирургическом отделении ФГБУ “НМИЦ эндокринологии” Минздрава России.

Продолжительность исследования

Набор пациентов в группы продолжался в течение трех лет – с 2012 по 2014 г. После проведенного лечения пациенты с ВДРЩЖ наблюдались на протяжении 43–68 мес, медиана 56 [50; 61] мес.

Описание медицинского вмешательства

Все пациенты до включения в исследование получали “Информацию для пациента и информированное согласие для участия в клиническом исследовании”. Участие было добровольным. Всем пациентам, включенным в исследование, проводили лабораторно-инструментальный комплекс для подготовки, проведения и послеоперационного наблюдения. Все пациенты были прооперированы. Всем пациентам, включенным в исследование, проводили молекулярно-генетическое исследование гистологического материала.

Основные исходы исследования

Основными конечными точками исследования были: частота рецидивов в группах различных вариантов лечения (ТЭ, ТЭ + ЦЛАЭ, ТЭ + ЦЛАЭ + РЙТ, ТЭ + РЙТ); встречаемость соматических мутаций в “горячих точках” генов BRAF, KRAS, NRAS, EIF1AX и TERT в гистологическом материале.

Дополнительные исходы исследования

Оценка времени до развития рецидива; оценка связи рецидивов с проведением профилактического удаления лимфоузлов центральной зоны (VI уровень); оценка связи рецидивов с проведением послеоперационной РЙТ; оценка связи рецидивов и выявленных мутаций.

Анализ в подгруппах

В зависимости от проведенного лечения все пациенты были распределены на группы: ТЭ, ТЭ + ЦЛАЭ, ТЭ + ЦЛАЭ + РЙТ, ТЭ + РЙТ. В данных подгруппах проводилась оценка связи выявленных рецидивов и проводимого лечения.

В зависимости от обнаружения/отсутствия мутации были выделены группы BRAF-позитивных пациентов (BRAF+) и BRAF-негативных пациентов (BRAF–). В данных подгруппах проводилась оценка связи выявленных рецидивов и встречаемости мутаций.

В группе пациентов, у которых был выявлен рецидив, проводили оценку времени до развития рецидива и связи с обнаружением мутаций.

Методы регистрации исходов

Под рецидивом/персистенцией опухоли понимали выявление заболевания не ранее чем через 6 мес после первичного лечения. Рецидивы заболевания были диагностированы при динамическом наблюдении по повышению уровня ТГ >1 нг/мл. Помимо ТГ динамически оценивали уровень антител к тиреоглобулину (АТ-ТГ), наличие остаточной тиреоидной ткани по УЗИ, в отдельных случаях результаты СВТ. Контрольное обследование пациентов проводили в течение первых 24 мес с частотой 1 раз в 3 мес, далее с частотой 1 раз в 6 мес. Определение уровня ТГ проводили иммунометрическим методом с функциональной чувствительностью не менее 0,1 нг/мл.

Гистологический материал был предоставлен в виде парафиновых блоков с операционным материалом. На основании данных морфологических исследований выбирали наиболее информативный блок и оценивали его на предмет соответствия критериям достоверного молекулярного исследования опухолевых клеток. Выделение ДНК из срезов с парафиновых блоков осуществляли с помощью набора реагентов “Экстракт ДНК FFPE” (ЗАО “Евроген”, Москва, РФ) в соответствии с инструкцией производителя. Концентрацию и качество выделенной ДНК оценивали с использованием набора реагентов “aXY-Детект” (ООО НПФ “Синтол”, Москва, РФ) в соответствии с инструкцией производителя. Всего было отобрано 90 блоков от 90 пациентов. ДНК, выделенная из 90 образцов, по концентрации и качеству соответствовала критериям для достоверного ПЦР-анализа мутаций.

Секвенирование по Сэнгеру проводили в специализированной лаборатории ЗАО “Евроген Ру” на аппарате “ABI 3500” (Applied Biosystems – часть Thermo Fisher Scientific, США) с использованием рекомендованных производителем наборов реагентов и стандартных операционных процедур. Исследовали только образцы, из которых удалось выделить достаточное количество ДНК.

Поиск мутаций в “горячих точках” генов BRAF (экзон 15) и NRAS (экзон 3, район кодона 61) в ДНК образцов проводили методом мутационно-специфической ПЦР в режиме реального времени с верификацией положительных и сомнительных результатов методом секвенирования продуктов ПЦР по Сэнгеру. Использовали наборы реагентов “Инсайдер BRAF” и “Инсайдер NRAS” (ЗАО “Евроген”) в соответствии с инструкцией производителя.

Поиск мутаций в других “горячих точках” гена NRAS (экзон 2, район кодонов 12 и 13; экзон 3, район кодона 59; экзон 4, район кодонов 117 и 146) и в “горячих точках” гена KRAS (экзон 2, район кодонов 12 и 13; экзон 3, район кодонов 59 и 61; экзон 4, район кодонов 117 и 146) в ДНК части образцов проводили методом мутационно-специфической ПЦР в режиме реального времени с верификацией положительных и сомнительных результатов методом секвенирования продуктов ПЦР по Сэнгеру. Использовали набор реагентов “Инсайдер PAN-RAS” (ЗАО “Евроген”) в соответствии с инструкцией производителя.

Поиск мутаций в “горячих точках” гена EIF1AX (экзон 6) в ДНК части образцов проводили методом ПЦР с последующим секвенированием продуктов ПЦР по Сэнгеру. Использовали набор реагентов “ГенСкан EIF1AX-6” (ООО “Евроген Лаб”) в соответствии с инструкцией производителя. Исследовали только образцы, в которых обнаруживались мутации в генах NRAS или KRAS.

Поиск мутаций в “горячих точках” гена TERT (транскрипт NM_198253.2, промоторная область) в ДНК образцов проводили методом ПЦР с последующим секвенированием продуктов ПЦР по Сэнгеру. Использовали набор реагентов “ГенСкан TERT” (ООО “Евроген Лаб”) в соответствии с инструкцией производителя.

Этическая экспертиза

Протокол исследования был одобрен Межвузовским комитетом по этике (выписка из протокола № 02-12 Межвузовского комитета по этике от 16.02.2012).

Статистический анализ

Размер выборки был рассчитан для уровня статистической значимости не менее 95% с ДИ ±5%. Учитывая небольшие объемы выборок и распределения, отличающиеся от нормального, были использованы непараметрические методы анализа данных. Для оценки значимости различий данных в группах применялся метод Манна–Уитни (для двух независимых групп), для сравнения более двух независимых выборок использовался тест Крускала–Уоллиса (критерий Н). Для сравнения относительных показателей использовался критерий χ2 (хи-квадрат). Статистическая обработка результатов исследования выполнена с использованием пакета прикладных программ Statistica v 10.0 for Windows (Dell, США). Данные в тексте и в таблицах представлены в виде медианы и межквартильного размаха. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимался равным 0,05.

Результаты

Объекты (участники) исследования

В исследование было включено 90 пациентов с ВДРЩЖ. Характеристика пациентов, включенных в исследование, представлена в табл. 1.

Характеристики пациентов, включенных в группы, в зависимости от варианта проведенного лечения приведены в табл. 2.

 

Таблица 1. Характеристика пациентов, включенных в исследование

Показатель

Значение

Средний возраст, лет

51 [40; 58]

Пол (м/ж)

15/75

ТТГ, мЕд/л

1,8 [1,05; 2,55]

Показатель

Значение

По данным гистологического исследования

Количество фокусов РЩЖ

1

2

3

>3

 

68 (75,6%)

8 (8,9%)

5 (5,5%)

9 (10%)

Наличие капсулы узла

43 (47,8%)

Инвазия РЩЖ

Нет

Инвазия в капсулу образования

Инвазия в капсулу/ткань ЩЖ/окружающие ткани

 

35 (38,9%)

19 (21,1%)

36 (40%)

Наличие метастазов в лимфоузлы

Нет

1–2

>2

 

80 (88,9%)

6 (6,7%)

4 (4,4%)

Гистологическая форма РЩЖ

Папиллярный РЩЖ

Фолликулярный вариант папиллярного РЩЖ

Фолликулярный РЩЖ

 

86 (95,6%)

2 (2,2%)

2 (2,2%)

 

Таблица 2. Характеристика пациентов группы ВДРЩЖ, разделенных на группы в зависимости от проведенного лечения

Показатель

ТЭ
(
n = 17)

ТЭ + ЦЛАЭ
(
n = 26)

ТЭ + ЦЛАЭ + РЙТ
(n = 32)

ТЭ + РЙТ
(n = 15)

Значение p

Возраст, лет

54 [45; 58]

50 [40,7; 55,7]

48 [38; 58]

52 [37,5; 60]

р = 0,825

Пол (м/ж)

2/15

2/24

8/24

3/12

р = 0,318

ТТГ на момент операции, мЕд/л

1,45 [1,02; 1,87]

1,55 [1,07; 2,87]

1,8 [0,9; 2,5]

2,8 [2,0; 3,5]

р = 0,257

По данным гистологического исследования

Более 1 фокуса РЩЖ, n (%)

1 (5,9%)

6 (23%)

10 (31,2%)

6 (15%)

р = 0,126

Наличие метастазов в лимфатических узлах, n (%)

0 (0%)

0 (0%)

9 (28,1%)

1 (6,7%)

р < 0,01

Инвазия в капсулу/ткань ЩЖ, n (%)

8 (47%)

14 (53,8%)

24 (75%)

9 (60%)

р = 0,272

Максимальный размер узла, см

1,5 [0,95; 2,75]

1,1 [0,9; 1,7]

1,35 [1,1; 1,67]

1,05 [0,8; 1,52]

р = 0,143

 

Значимых отличий между группами по возрасту, полу и исходному уровню тиреотропного гормона (ТТГ) не было. По результатам проведенного гистологического исследования закономерно выше была распространенность метастазов в регионарные лимфоузлы в группах терапии с использованием радиоактивного йода (р < 0,01), отличий по инвазии опухоли в капсулу и ткань ЩЖ, максимальному размеру фокуса, встречаемости более 1 фокуса РЩЖ между группами не было (р > 0,05).

Основные результаты исследования

Определение частоты рецидивов

После проведенного лечения пациентов наблюдали на протяжении 43–68 мес; медиана 56 [50; 61] мес. Длительность наблюдения не отличалась между группами терапии. В общей когорте у 12 (13,3%) пациентов диагностирован рецидив РЩЖ. Группы без рецидива/с рецидивом не отличались по полу, возрасту и длительности наблюдения. Характеристика пациентов в зависимости от развития рецидива представлена в табл. 3. Частота развития рецидивов и длительность динамического наблюдения пациентов в зависимости от варианта лечения представлены в табл. 4. Получены значимые различия по частоте развития рецидивов между группами лечения.

Таблица 3. Характеристика пациентов с ВДРЩЖ (n = 90) в зависимости от развития рецидива

Показатель

Нет рецидива

Рецидив

Значение p

Пациенты, n

78

12

 

Возраст, лет

52 [42; 58]

43 [37; 58]

р = 0,261

Пол (м/ж)

65/13

10/2

р =1

ТТГ, мЕд/л

1,45 [0,82; 2,52]

2,1 [1,4; 2,5]

р = 0,093

Время наблюдения, мес

56 [50; 61]

59 [48; 62]

р = 0,401

РЙТ, n (%)

45 (57,7%)

2 (16,6%)

р = 0,009

ТГ, нг/мл (среднее ± СКО)

0,12 ± 0,09

9,02 ± 30,25

р < 0,000002

АТ-ТГ, ед/мл (среднее ± СКО)

28,11 ± 36,30

29,58 ± 16,22

р = 0,11

Остаточная ткань по УЗИ

0 (0%)

5 (41,7%)

р < 0,001

Ультразвуковые характеристики узловых образований

Максимальный размер узла, см

1,30 [0,90; 1,63]

1,15 [1,00; 1,90]

р = 0,481

Билатеральность, n (%)

4 (5,1%)

1 (8,3%)

р = 0,010

Наличие кальцинатов, n (%)

34 (43,5%)

8 (66,7%)

р = 0,136

Гипоэхогенность образования, n (%)

60 (76,9%)

9 (75,0%)

р = 0,884

Нечеткость/неровность контуров, n (%)

18 (23%)

1 (8,3%)

р = 0,244

Гистологическое исследование послеоперационного материала

Мультифокальность (>1 фокуса), n (%)

18 (23,1%)

4 (33,3%)

р = 0,442

Наличие метастазов в лимфатических узлах, n (%)

8 (10,3%)

2 (16,6%)

р = 0,511

Наличие капсулы ВДРЩЖ, n (%)

32 (41,0%)

9 (75,0%)

р = 0,028

Инвазия РЩЖ, n (%)

45 (57,7%)

2 (16,6%)

р = 0,090

BRAF, n (%)

44 (56,4%)

9 (75,0%)

р = 0,224

NRAS, n (%)

3 (3,8%)

1 (8,3%)

р = 0,506

 

Таблица 4. Длительность динамического наблюдения, частота рецидивов и частота встречаемости BRAF-мутации при различных вариантах лечения

Показатель

ТЭ
(
n = 17)

ТЭ + ЦЛАЭ
(n = 26)

ТЭ + ЦЛАЭ + РЙТ
(
n = 32)

ТЭ + РЙТ
(n = 15)

Значение p

Длительность наблюдения, мес

53 [49; 60]

58 [51; 62]

56 [50; 61]

59,5 [54; 62,7]

р = 0,594

Развитие рецидива в общей когорте, n (%)

3 (17,6%)

7 (26,9%)

2 (6,25%)

0 (0%)

р = 0,044

Наличие BRAF-мутации, n (%)

9 (52,9%)

16 (61,5%)

22 (68,7%)

6 (42,8%)

р = 0,282

Развитие рецидива, n (%)

2 BRAF+ и 1 BRAF-

5 BRAF+ и 2 BRAF-

2 BRAF+

0 (0%)

 

Встречаемость соматических мутаций в “горячих точках” генов BRAF, KRAS, NRAS, EIF1AX и TERT в гистологическом материале

BRAF. Поиск мутаций в “горячих точках” гена BRAF (экзон 15, район кодонов 600–601) выполнен в образцах ДНК, выделенной из гистологического материала 90 пациентов с ВДРЩЖ. Мутации обнаружены в 53 случаях, в том числе: c.1799T>A, p.(Val600Glu, V600E) [COSMIC ID 476] – у 50 пациентов; c.1799_1800TG>AT, p.(Val600Asp, V600D) [COSMIC ID 477] – у 1 пациента; c.1801A>G, p.(Lys601Glu, K601E) [COSMIC ID 478] – у 1 пациента; c.1794_1796delTAC, p.(Thr599del, T599del) [COSMIC ID 1169497] – также у 1 пациента. Данные представлены в табл. 5. По результатам гистологического исследования операционного материала у 53 пациентов с мутациями в гене BRAF был выявлен ПРЩЖ. Таким образом, частота встречаемости мутации в гистологическом материале составила 58,9%.

 

Таблица 5. Частота встречаемости мутаций в “горячих точках” гена BRAF (экзон 15, район кодонов 600–601) в гистологическом материале

Вариант мутации

Секвенограмма

Мутации в гистологическом материале
(n = 90, n BRAF+ = 53 (58,9%))

Нет мутации (дикий тип)

 

37

c.1799T>A, p.(Val600Glu, V600E) [COSMIC ID 476]

 

50

c.1799_1800TG>AT, p.(Val600Asp, V600D) [COSMIC ID 477]

 

1

c.1801A>G, p.(Lys601Glu, K601E)
[COSMIC ID 478]

 

1

c.1794_1796delTAC,
p.(Thr599del, T599del)
[COSMIC ID 1169497]

 

1

 

NRAS. Поиск мутаций в “горячих точках” гена NRAS (экзон 3, район кодона 61) выполнен в образцах ДНК, выделенной из гистологического материала 90 пациентов с ВДРЩЖ. Мутации обнаружены в 4 случаях, в том числе c.182A>G, p.(Gln61Arg, Q61R) [COSMIC ID 584] – у 4 пациентов. Данные представлены в табл. 6. По результатам гистологического исследования операционного материала у 4 пациентов с мутациями в гене NRAS был выявлен ПРЩЖ. Таким образом, частота встречаемости мутации в гистологическом материале составила 4,4%.

 

Таблица 6. Частота встречаемости мутаций в “горячих точках” гена NRAS (экзон 3, район кодона 61) в гистологическом материале

Вариант мутации

Секвенограмма

Мутации в гистологическом материале
(n = 90, n NRAS+ = 4 (4,4%))

Нет мутации (дикий тип)

 

86

c.182A>G, p.(Gln61Arg, Q61R)
[COSMIC ID 584]

 

4

 

KRAS, EIF1AX, TERT. Мутации в других “горячих точках” гена NRAS (экзон 2, район кодонов 12 и 13; экзон 3, район кодона 59; экзон 4, район кодонов 117 и 146), а также в “горячих точках” гена KRAS (экзон 2, район кодонов 12 и 13; экзон 3, район кодонов 59 и 61; экзон 4, район кодонов 117 и 146), EIF1AX (экзоны 1, 2 и 6) и TERT (транскрипт NM_198253.2, промоторная область, район позиций c.1-146 – c.1-124) не обнаружены ни в одном образце.

Дополнительные результаты исследования

Время до развития рецидива

Время до развития рецидива и встречаемость мутаций BRAF и NRAS в образцах пациентов с рецидивом представлены на рис. 2. Большая часть рецидивов была отмечена через 6 мес после первичного лечения, после 24 мес наблюдения рецидивов зарегистрировано не было. Все рецидивы ответили на РЙТ, и персистенции заболевания не наблюдается ни в одном случае.

 

Рис. 2. Время до развития рецидива и встречаемость мутаций BRAF и NRAS в образцах пациентов с рецидивом.

 

Связь рецидивов и ЦЛАЭ

При сравнении групп, в которых проводилась ТЭ (n = 32) и ТЭ + ЦЛАЭ (n = 58), статистически значимых отличий по частоте развития рецидивов не получено (p = 0,412).

Связь рецидивов и РЙТ

При сравнении групп, в которых проводилась РЙТ (n = 47) и не проводилась РЙТ (n = 43), получены статистически значимые отличия по частоте развития рецидивов (p = 0,009).

Связь мутаций и рецидивов в группе ВДРЩЖ

При сравнении в группах BRAF+/BRAF– значимых отличий по возрасту, полу, уровню ТТГ выявлено не было. По частоте выявления подозрительных в отношении злокачественности ультразвуковых характеристик, таких как наличие кальцинатов, значимых отличий между группами BRAF+/BRAF– отмечено не было, но гипоэхогенность узлового образования значимо чаще отмечена в группе пациентов с мутацией BRAF (р = 0,007), и неровность/нечеткость контуров узлового образования значимо чаще отмечена в группе пациентов с мутацией BRAF = 0,032). При сравнении гистологических характеристик в группах BRAF+/BRAF– значимых отличий по частоте мультифокального поражения, метастазов в регионарные лимфоузлы, наличию капсулы и инвазии рака выявлено не было, однако чаще в этой группе выявлялось мультифокальное поражение (наличие >1 фокуса). Данные представлены в табл. 7.

 

Таблица 7. Характеристика пациентов с ВДРЩЖ (n = 90) в зависимости от наличия у них BRAF-мутации

Показатель

BRAF+

BRAF -

Значение p

Пациенты, n

53

37

 

Возраст, лет

51 [42,5; 57]

52 [40; 60]

р = 0,605

Пол (м/ж)

6/45

5/32

р = 0,906

ТТГ, мЕд/л

1,45 [0,82; 2,52]

2,1 [1,4; 2,5]

р =0,093

Ультразвуковые характеристики узловых образований

Максимальный размер узла, см

1,2 [1,0; 1,6]

1,3 [1,0; 1,7]

р = 0,614

Билатеральность, n (%)

2 (3,8%)

3 (8,1%)

р = 0,378

Наличие кальцинатов, n (%)

25 (47,1%)

17 (45,9%)

р = 0,91

Гипоэхогенность образования, n (%)

46 (88,5%)

23 (62,2%)

р = 0,007

Нечеткость/неровность контуров, n (%)

35 (83,3%)

16 (43,2%)

р = 0,032

Гистологическое исследование послеоперационного материала

Мультифокальность (>1 фокуса), n (%)

14 (26,4%)

8 (21,6%)

р = 0,65

Наличие метастазов в лимфатических узлах, n (%)

9 (17%)

1 (2,7%)

р = 0,38

Наличие капсулы ВДРЩЖ, n (%)

25 (47,1%)

16 (43,2%)

р = 0,80

Инвазия РЩЖ, n (%)

30 (56,6%)

22 (59,4%)

р = 0,67

Рецидив, n (%)

9 (17,0%)

3 (8,1%)

р = 0,24

     

 

По результатам динамического наблюдения значимых отличий между группами BRAF+/ BRAF– по частоте развития рецидивов не выявлено.

Данные о частоте встречаемости мутации BRAF и частоте рецидивов в группах разного лечения представлены в табл. 4.

Несмотря на то что значимых отличий между группами BRAF+/BRAF– по частоте развития рецидивов не выявлено, обращает на себя внимание тот факт, что подавляющее число рецидивов является BRAF+, а именно 9 случаев из 12 являются BRAF+ (75%).

Частота развития рецидивов среди пациентов с выявленной мутацией NRAS составила 1 случай из 4 (25%).

В целом, из 12 случаев рецидива мутация BRAF выявлена в 9 случаях и мутация NRAS выявлена в 1 случае, то есть в 10 случаях из 12 (83,3%). В группе пациентов без рецидивов частота мутаций суммарно составила 47 случаев из 78 (60%).

Нежелательные явления

У части пациентов после оперативного вмешательства отмечались клинические и лабораторные признаки транзиторной гипокальциемии, которые быстро купировались приемом препаратов кальция и витамина D.

Обсуждение

Резюме основного результата исследования

По результатам исследования гистологических пациентов с малыми опухолями щитовидной железы можно сделать следующие выводы:

  • в наблюдаемой группе пациентов с ВДРЩЖ у 12 (13,3%) пациентов развился рецидив РЩЖ;
  • частота обнаружения мутации BRAF в группе ВДРЩЖ в гистологическом материале составила 58,9%;
  • частота обнаружения мутации NRAS в группе ВДРЩЖ в гистологическом материале составила 4,4%;
  • у пациентов с малыми опухолями ЩЖ не были обнаружены мутации в других “горячих точках” гена NRAS и генов KRAS, TERT, EIF1AX;
  • значимых отличий по частоте рецидивов в зависимости от варианта хирургического лечения не выявлено;
  • значимых отличий по частоте рецидивов между группами BRAF+/BRAF– не выявлено, однако обращает на себя внимание, что подавляющее число рецидивов является BRAF+;
  • в связи с небольшим количеством пациентов с выявленной мутацией NRAS сделать вывод о значимости отличий по частоте рецидивов между группами NRAS+/NRAS– нельзя.

Обсуждение основного результата исследования

Частота выявленных мутаций BRAF в гистологическом материале при ВДРЩЖ в нашем исследовании составила 58,9%. В подавляющем большинстве случаев выявлена мутация c.1799T>A, p.(Val600Glu, V600E) (94,4%), которая является наиболее распространенной в популяции, и в трех случаях выявлены точечные мутации c.1799_1800TG>AT, p.(Val600Asp, V600D), c.1801A>G, p.(Lys601Glu, K601E), c.1794_1796delTAC, p.(Thr599del, T599del). Все мутации выявлены при ПРЩЖ.

Частота выявленных мутаций NRAS в гистологическом материале при ВДРЩЖ в нашем исследовании составила 4,4%. Была выявлена наиболее часто встречающаяся мутация c.182A>G, p.(Gln61Arg, Q61R).

Не было выявлено мутаций в “горячих точках” генов NRAS (экзон 2, район кодонов 12 и 13; экзон 3, район кодона 59; экзон 4, район кодонов 117 и 146); KRAS (экзон 2, район кодонов 12 и 13; экзон 3, район кодонов 59 и 61; экзон 4, район кодонов 117 и 146), TERT (транскрипт NM_198253.2, промоторная область, район позиций c.1-146 – c.1-124), EIF1AX. Отсутствие выявления данных мутаций, возможно, связано с характером набранной группы пациентов, включенных в исследование, поскольку в исследование исходно набирались пациенты с ВДРЩЖ низкого риска, для которых не характерно агрессивное течение заболевания, с которым связывают выявление данных маркеров.

В наблюдаемой группе пациентов с ВДРЩЖ у 12 (13,3%) пациентов диагностирован рецидив РЩЖ, что соответствует средней частоте рецидивов в группе ВДРЩЖ от 9,6 до 25% [14].

Значимых отличий по частоте рецидивов в зависимости от варианта хирургического лечения не выявлено, то есть клинически значимых преимуществ комбинированного лечения ТЭ + ЦЛАЭ перед ТЭ при лечении пациентов с ВДРЩЖ низкого риска нет.

Представляет интерес то, что при анализе групп, получавших и не получавших РЙТ, было выявлено, что риск рецидива значимо выше в группах без РЙТ, что, с одной стороны, нельзя объяснить разницей клинической или гистологической картины пациентов с/без РЙТ, а с другой – говорит о высокой эффективности предотвращения риска рецидива при назначении РЙТ даже в случае исходно РЩЖ низкого риска. Для решения данного вопроса необходимы дополнительные проспективные исследования на большей выборке пациентов.

Значимых отличий по частоте рецидивов между группами BRAF+/BRAF– не выявлено, несмотря на то что подавляющее число рецидивов является BRAF+. Что согласуется с частью исследований данного маркера, где не было получено данных о влиянии на прогноз единичной мутаци BRAF.

Отсутствие выявления генов агрессивного течения заболевания EIF1AX и TERT или их комбинаций не может однозначно говорить о том, что данные мутации нельзя использовать для прогнозирования течения заболевания пациента, поскольку в нашем исследовании все пациенты относились к группе низкого риска. Все рецидивы ответили на РЙТ, и персистенции заболевания не наблюдается ни в одном случае, поэтому, возможно, отсутствие выявления мутаций указывает на благоприятный прогноз у данных пациентов.

Ограничения исследования

Поскольку в исследование были включены только пациенты с ВДРЩЖ низкого риска, то, возможно, включение пациентов с ВДРЩЖ высокого риска могло бы значимо повлиять на результаты.

Заключение

Таким образом, на основании полученных данных можно сделать вывод о том, что течение заболевания у пациентов с ВДРЩЖ группы низкого риска отличается крайне благоприятным прогнозом даже в случае раннего рецидива. В настоящем исследовании комплексные методы лечения не показали клинически значимых преимуществ перед тиреоидэктомией при лечении пациентов с микрокарциномами ЩЖ, что говорит об отсутствии необходимости более агрессивного вмешательства.

Не получено данных за информативность использования у таких пациентов тестов на мутации в “горячих точках” генов BRAF, KRAS, NRAS, EIF1AX и TERT для прогнозирования течения заболевания, хотя отсутствие выявления генов агрессивного течения заболевания, возможно, указывает на благоприятный прогноз у данных пациентов.

Полученные в ходе исследования результаты позволят улучшить подходы к персонифицированному ведению пациентов и дают направления для дальнейших проспективных исследований.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Исследование выполнено при поддержке Российского научного фонда (грант РНФ № 14-35-00105 “Комплексное исследование молекулярной эволюции злокачественных опухолей для разработки персонифицированных подходов к ведению онкологических больных”).

Участие авторов: Качко В.А. – проведение, концепция и дизайн исследования, сбор и обработка материалов, анализ полученных данных и написание текста; Ванушко В.Э., Платонова Н.М. – концепция и дизайн исследования, анализ полученных данных и написание текста. Все авторы внесли существенный вклад в проведение исследования и публикацию статьи, прочли и одобрили финальную версию до публикации.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Благодарности. Коллектив авторов выражает благодарность сотрудникам отдела молекулярной онкологии ООО “Евроген Лаб” А.Р. Зарецкому, О.В. Дрозду, Л.В. Чудаковой и Д.С. Стоклицкой за помощь в проведении исследования.

Vera A. Kachko

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Author for correspondence.
Email: VeraF246@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-0617-7312
SPIN-code: 5869-7470

Russian Federation, 8-2, Trubetskaya street, Moscow, 119992

postgraduate student

Vladimir E. Vanushko

Endocrinology Research Centre

Email: vanushko@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-6338-7490
SPIN-code: 6097-8990

Russian Federation, 11 Dm.Ulyanova street, 117036 Moscow

MD, PhD

Nadezhda M. Platonova

Endocrinology Research Centre,

Email: doc-platonova@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0001-6388-1544
SPIN-code: 4053-3033

Russian Federation, 11 Dm.Ulyanova street, 117036 Moscow

MD, PhD

  1. Бельцевич Д.Г., Ванушко В.Э., Румянцев П.О. и др. Российские клинические рекомендации по диагностике и лечению высокодифференцированного рака щитовидной железы у взрослых, 2017 год. // Эндокринная хирургия. – 2017. – Т. 11. – №1. – С. 6-27. doi: https://doi.org/10.14341/serg201716-27. [Beltsevich DG, Vanushko VE, Rumyantsev PO, et al. 2017 Russian clinical practice guidelines for differentiated thyroid cancer diagnosis and treatment. Endocrine Surgery. 2017;11(1):6-27. doi: https://doi.org/10.14341/serg201716 -27. (In Russ.)]
  2. Xing M. Molecular pathogenesis and mechanisms of thyroid cancer. Nat Rev Cancer. 2013;13(3):184-199. doi: https://doi.org/10.1038/nrc3431.
  3. Younis E. Oncogenesis of thyroid cancer. Asian Pac J Cancer Prev. 2017;18(5):1191-1199. Published. doi: https://doi.org/10.22034/APJCP.2017.18.5.1191.
  4. Tufano RP, Teixeira GV, Bishop J, et al. BRAF mutation in papillary thyroid cancer and its value in tailoring initial treatment: a systematic review and meta-analysis. Medicine (Baltimore). 2012;91:274-286.
  5. Xing M, Alzahrani AS, Carson KA, et al. Association between BRAF V600E mutation and mortality in patients with papillary thyroid cancer. JAMA. 2013;309:1493-1501.
  6. Howell GM, Hodak SP, Yip L. RAS mutations in thyroid cancer. Oncologist. 2013;18(8):926-932.
  7. Gandolfi G., Ragazzi M., Frasoldati A., et al. TERT promoter mutations are associated with distant metastases in papillary thyroid carcinoma. Eur J Endocrinol. 2015;172:403-413. doi: https://doi.org/10.1530/EJE-14-0837.
  8. Liu X., Qu S., Liu R., et al. TERT promoter mutations and their association with BRAF V600E mutation and aggressive clinicopathological characteristics of thyroid cancer. J Clin Endocrinol Metab. 2014;99:E1130-E1136. doi: https://doi.org/10.1210/jc.2013-4048.
  9. Liu T., Yuan X., Xu D. Cancer-Specific Telomerase Reverse Transcriptase (TERT) promoter mutations: biological and clinical implications. Genes. 2016;7(7):38. doi: https://doi.org/10.3390/genes7070038.
  10. Liu X, Bishop J, Shan Y, et al. Highly prevalent TERT promoter mutations in aggressive thyroid cancers. Endocr Relat Cancer. 2013;20:603-610.
  11. Liu R., Xing M. TERT promoter mutations in thyroid cancer. Endocr Relat Cancer. 2016;23(3):R143-R155. doi: https://doi.org/10.1530/ERC-15-0533.
  12. Jin A., Xu J., Wang Y. The role of TERT promoter mutations in postoperative and preoperative diagnosis and prognosis in thyroid cancer. Medicine (Baltimore). 2018;97(29):e11548. doi: https://doi.org/10.1097/MD.0000000000011548.
  13. Karunamurthy A, Panebianco F, J Hsiao S, et al. Prevalence and phenotypic correlations of EIF1AX mutations in thyroid nodules. Endocr Relat Cancer. 2016;23(4):295-301. doi: https://doi.org/10.1530/ERC-16-0043.
  14. Abdullah MI, Junit SM, Ng KL, et al. Papillary thyroid cancer: genetic alterations and molecular biomarker investigations. Int J Med Sci. 2019;16(3):450-460. Published 2019 Feb 28. doi: https://doi.org/10.7150/ijms.29935
  15. COSMIC [Internet]. Catalogue of somatic mutations in cancer [cited 2018 Dec 12]. Available from: https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic.
  16. EnsEMBL [Internet]. Genome browser [cited 2018 Dec 12]. Available from: http://www.ensembl.org.

Supplementary files

Supplementary Files Action
1. Fig. 1. Study design. View (176KB) Indexing metadata
2. Fig. 2. Time to relapse and the incidence of BRAF and NRAS mutations in patients with relapse. View (211KB) Indexing metadata

Views

Abstract - 115

PDF (Russian) - 27

Cited-By



Copyright (c) 2019 Kachko V.A., Vanushko V.E., Platonova N.M.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies